肝細胞肝癌（hepatocellularcarcinoma,HCC）是常見的惡性腫瘤之一，也是導致癌癥死亡的第二大常見原因。近年來，特別是亞洲國家的發病率和病死率有所增加。雖然手術切除和肝移植是治療ＨＣＣ的主要方法，但大多數患者明確診斷時已處于ＨＣＣ晚期，失去手術機會，導致預后較差。雖然ＨＣＣ與多種表觀遺傳學和遺傳學改變有關，但其發病的潛在分子機制尚不清楚，缺乏有效的生物標志物，嚴重制約著ＨＣＣ的早期診斷、預后評估和治療。microRNAs（miRNAs）是一類內源性非編碼小ＲＮＡ分子，由２２個核苷酸組成，其主要功能是能夠通過與靶ｍＲＮＡｓ的３′－ＵＴＲ結合，抑制靶ｍＲＮＡｓ的翻譯或剪切，從而對靶基因進行轉錄后水平的調控。miRNAs與多種人類癌癥的發生發展密切相關。研究發現，多種ｍｉＲＮＡ在肝癌發生發展過程中異常表達，這種異常的表達可以作為肝癌早期診斷、預后評估和治療的有效靶點［１］。ｍｉＲ－１２２作為miRNAs家族的重要一員，其在肝癌進程中的作用機制受到人們的關注。有研究表明，miR-122可以通過影響絲氨酸／蘇氨酸激酶、細胞周期蛋白Ｇ１途徑抑制腫瘤進展，但是目前這些研究遠遠不能解釋miR-122抑制腫瘤進展的作用機制，致使對miR-122功能的研究受到了很大的限制。本研究應用生物信息學軟件預測miR-122可能的靶基因，并應用雙螢光素酶實驗及Westernblot實驗進行驗證，確定miR-122在肝癌細胞中的靶基因，進一步行體外細胞實驗，驗證miR-122及其靶基因對肝癌細胞生物活性的影響，旨在為深入研究ｍｉＲ－１２２在ＨＣＣ進程中的作用機制提供研究線索，并為臨床探索ＨＣＣ早期診斷、治療ＨＣＣ的有效途徑提供可靠依據。

miR-122靶基因的生物信息學分析應用生物信息學軟件microRNA.org、TargetScan和miRanda預測miR-122的可能的靶基因。

肝癌細胞培養人肝癌細胞株ＳＭＭＣ７７２１和Ｈｅｐ３Ｂ購自中國科學院。肝癌細胞株正常傳代并維持于含有１０％胎牛血清的ＤＭＥＭ培養基中，于含有５％ＣＯ２的３７℃細胞培養箱中培養。雙熒光素酶報告基因實驗將ＬＭＮＢ２ＵＴＲ的野生型和突變體插入熒光素酶下游，分別構建ｐＧＬ３－ＬＭＮＢ２ＵＴＲＷＴ和ｐＧＬ３－ＬＭＮＢ２ＵＴＲＭｕｔ質粒，并轉染到ＳＭＭＣ７７２１細胞中，同時在ＳＭＭＣ７７２１細胞中轉染miR-122ｍｉｍｉｃｓ。使用雙熒光素酶檢測系統檢測熒光素酶活性。并應用腎熒光素酶活性對結果進行標準化。

Westernblot實驗將對數生長期的人肝癌細胞株Ｈｅｐ３Ｂ和ＳＭＭＣ７７２１接種于６孔板中常規培養，待細胞株生長至８０％時，分別轉染miR-122ｍｉｍｉｃｓ和miR-122ＡＳＯ，各組均設立空白對照。繼續培養４８ｈ后每孔加入ＲＩＰＡ裂解液進行細胞裂解，４℃環境作用３０ｍｉｎ，收集上清定量，然后按比例與上樣緩沖液混勻，１００℃煮５ｍｉｎ后放置１０ｍｉｎ，應用１０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ進行電泳，并電轉移至硝酸纖維素膜上。應用５％脫脂牛奶封閉２ｈ，加入ＬＭＮＢ２抗體（１∶１０００）和β－ａｃｔｉｎ抗體（１∶５０００），４℃過夜，應用ＴＢＳＴ洗滌。加入抗兔抗體（１∶２５００），室溫下孵育１ｈ，加入發光試劑，于暗室曝光、壓片、顯影、定影。測定靶基因條帶亮度值，繪制柱狀。

針對目前的研究現狀，本研究應用生物信息學軟件預測miR-122的靶基因，并應用熒光素酶報告基因實驗和Westernblot實驗證實miR-122對靶基因的調控作用。然后應用菌落形成試驗和Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ細胞侵襲實驗分析靶基因對肝癌細胞生物活性的影響。最終發現ＬＭＮＢ２是miR-122的下游靶基因；miR-122可降低肝癌細胞中ＬＭＮＢ２的表達；在肝癌細胞Ｈｅｐ３Ｂ中過表達ＬＭＮＢ２可促進肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲；在肝癌細胞ＳＭＭＣ７７２１中抑制ＬＭＮＢ２表達，可降低肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲。總之，miR-122可以通過靶定ＬＭＮＢ２抑制肝癌細胞的生物活性，其可以作為肝細胞肝癌早期診斷指標及治療靶點。