羊肚菌(Morchella)是一種野生珍貴菌,由于 其菌蓋表面凹凸不平,狀如羊肚,故名羊肚菌?羊 肚菌為羊肚菌科盤菌目珍稀的食藥兩用真菌?羊 肚菌肉質脆嫩,風味獨特,味道鮮美,營養和藥用 價值極高?羊肚菌既是宴會上的佳肴,又 是久負盛名的良藥,曾經作為珍惜貢品獻給皇帝享 用?在我國,有關羊肚菌的藥用記載始于李時珍 的《本草綱目》“甘寒無毒?益腸胃?化氮理氣”? 如今羊肚菌已經成為歐洲國家著名的高級食材, 含有豐富的蛋白質?多種維生素及 20 多 種氨基 酸,味道鮮美,營養豐富?它與冬蟲夏草功能相同, 是一種不含任何激素?無任何副作用的天然滋補 品?羊 肚 菌 春 末 至 秋 初 生 長 于 海 拔 2000~ 3000m的針葉闊葉混交林中,在云南?四川?西 藏?貴州?遼寧等地有分布。

該研究通過利用高效毛細管電泳建立不同來 源的羊肚菌進行指紋圖譜,并結合相似度評價?聚 類分析及主成分分析等方法對8種羊肚菌樣品進 行相關分類,以期為全面評價羊肚菌提供有效方 法和科學依據。

供試羊肚菌菌種保存于遼寧省農業科學院食用菌研究所;主要來源于遼寧?武 漢和四川 (表1),Na2B4O7?H3BO3?Na2HPO4?NaH2PO4 (美國amresco生物試劑公司);試驗過程用的試 劑均為分析純和色譜純;試驗用水為超純水。

供試儀器:P/ACE MDQ 毛細管電泳儀(美國貝克曼公司);精密 pH 計(北京泰亞賽福科技發展有限責任公司);電子天平(賽多利斯);超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司);HZQ-QX 全溫振蕩器(哈爾濱市東聯電 子技術開發有限公司);干熱消毒箱(上海精宏實驗設備有限公司);A11高速粉碎機(德國IKA 集 團);CascadaTM實驗室超純水系統(Pallcorporation) 微孔濾膜(孔徑0.22μm,津隆設備有限公司)。

將實驗室保存的羊肚菌活化接種于馬鈴薯液 體培養基中,25 ℃,180r·min-1搖床培養7d? 將發酵 液 過 濾 后,用 無 菌 水 沖 洗 菌 絲 體 3 次, 60 ℃烘干,粉碎,過100目篩?得到的菌粉按照 1∶30加水,超聲30min,95 ℃水浴鍋保溫4h,過 濾后取上清液?將處理好的產物用0.22μm 孔 徑的水系濾膜過濾,收集續濾液加同體積的運行 緩沖液作為樣品溶液。

電泳操作條件如下:未涂層石英毛細管(50μm×48cm);運行緩沖液10mmol·L-1硼 砂緩沖液(pH9.21);10mmol·L-1硼酸緩沖液; 檢測波長214nm;分離電壓20kV;溫度 25 ℃;壓力0.5psi進樣10s,運行時間為30min?毛細 管柱用前依次用0.1mol·L-1NaOH 溶液?水? 運行緩沖液分別沖洗10min,進樣前用運行緩沖 液沖洗5min。

方法的精密度:取羊肚菌 LNY4菌粉溶液用 緩沖液配置成0.05mg·mL-1(按照上述色譜條 件)連續進樣測定5次,記錄遷移時間和峰面積, 計算遷移時間相對標準差(RSD)和峰面積的相對 標準差 (RSD)均 小 于 3%,表 明 儀 器 的 精 密 度 良好? 穩定性的測定:將羊肚菌 LNY4菌粉提取好 的樣品(按照上述的方法制得),分別在室溫下放 置0?2?4?6?8h后(按照上述的色譜條件)分別進 樣,計算得各共有峰相對保留時間的 RSD<1%, 相對峰面積的 RSD<3%,表明樣品在8h內各成 分穩定? 重現性試驗:取羊肚菌 LNY4菌粉(按照上 述的方法制得),同法制備7 個供試品進行檢測, 記錄和計算各峰相對保留時間和相對峰面積的 RSD均小于3%,表明該方法的重現性好? 方法準確性驗證:為驗證該研究的可靠性和 準確性,將8種羊肚菌樣品進行 DNA 的提取,并 建立 分 子 系 統 發 育 樹?2 條 PCR 引 物 分 別 為 ITS1 (5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和 ITS4 (5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)? PCR擴增反應程序為95 ℃ 預變性4min,95 ℃ 變性30s,57℃退火30s,72℃延伸60s,30個循 環,72 ℃延伸7min? 1.3 數據分析 對獲得的8種羊肚菌指紋圖譜采用 Excel和 SPSS軟件中的相似度評價?聚類分析和主成分 分析等方法進行分析或作圖?為確定羊肚菌毛細 管電 泳 圖 譜 的 特 征 峰 和 共 有 指 紋 圖 譜;利 用 Mega7.0軟件的 NJ法建立8種羊肚菌的分子系 統發育樹。

制定指紋圖譜標準常使用參比物,以確定圖譜中參照峰的位置和豐度?一般情況下參比 物選取容易獲取一個或一個以上的主要活性物 質,主要用于考察指紋圖譜的穩定程度和重現性, 該研究選取了重現率為100%,且分別在8個樣 品中峰面積最高占比為19.82%~29.06%的10 號峰為參比物。

一個品種的指紋圖譜是由各個具有指紋意義的峰組成的完整圖譜構成,各個有指紋意義的峰 的位置(保留時間)?大小或高低(相對面積或峰 高)?各峰之間相對的比例是指紋圖譜的綜合參數?供試品與對照樣品之間的相對峰面積積分相 差20%以上的,說明樣品含有的內在物質有較為 明顯“量”的差異?在相同色譜條件下對8種羊肚 菌樣品進行測試,以 10號峰為參照峰,計算其它 各峰 的 相 對 保 留 時 間 (表 2)和相對峰面積。

為選取適當的檢測波長,采用二極管檢測器 對樣品溶液在波長為190~300nm 范圍內進行 掃描,發現樣品在214nm 處能夠同時出峰且分 離效果較好,故選取此波長作為檢測波長?試驗 常用的磷酸鹽?硼砂等緩沖體系對樣品及對照品 的分離進行考察,以 選 取 合 適 的 緩 沖 體 系? 通 過磷酸鹽 緩 沖 液 不 同 的 pH,確 定 分 離 樣 品 的 最適 分 離 pH,通 過 試 驗 比 較 發 現,用 pH 為 9.21的磷酸鹽溶液分離時,樣品的分離效果較 好,故選擇堿性緩 沖 液 硼 砂 溶 液 進 一 步 進 行 優化?選擇 10?20?50?75mmol·L-1硼砂緩沖液 對樣品進行分離?結果發現當硼砂緩沖液濃度達 到10mmol·L-1時,樣品和對照品的分離效果最 佳,分離度和峰形都達到了相對最好的情況,故選 10mmol·L-1及pH 為9.21的硼砂,10mmol·L-1 硼酸緩沖液緩沖體系作為最終運行緩沖液?并在 此條件下進行波長優化及電壓優化?在優化分離 電壓時,比較分析15?20?30kV3個不同電壓下 樣品的遷移與分離情況,發現在15kV 時,基線 不好,30kV 時出峰延遲,峰形拖尾,故最終選擇 20kV 作為電泳測定的運行電壓。