知母為百合科植物知母 ( Anemarrhena asphodeloides Bge．) 的干燥根莖，具有清熱瀉火、滋陰 潤燥的功效。知母皂苷是知母的主要有效成分， 含量 約 為 6%，包括呋甾皂苷如知母皂苷 B Ⅱ ( timosaponin BⅡ，TBⅡ) 、螺甾皂苷如知母皂苷 AⅢ ( timosaponin AⅢ，TAⅢ) 和知母皂苷元( sarsasapogenin， SAＲ) 等。

1 實驗材料

1．1 菌株

ATCC 標(biāo) 準(zhǔn) 株: 白 念 珠 菌 ( Candida albicans) SC5314 和 Y0109、新型隱球菌( Cryptococcus neoformans) ATCC32609，由上海長征醫(yī)院菌種保存 中 心 贈 送。臨 床 株: 紅 色 毛 癬 菌 ( Trichophytonrubrum) 、石膏樣小孢子菌( Microsporum gypseum) 、 須癬毛癬菌( Trichophyton mentagrophytes) ，均由上海 長海醫(yī)院真菌室提供，采自該院不同科室的臨床樣 本，并經(jīng)形態(tài)學(xué)和生化學(xué)鑒定。

1．2 藥物及試劑

知母飲片，上海康橋藥業(yè)有限公 司( 批號: 170305) ; TBⅡ和 TAⅢ對照品，純度＞98%，上海源葉生物科技有限公司; β-葡萄糖苷酶，上海寶 豐生化有限公司; 氟康唑注射液，輝瑞制藥有限公司 ( 批號: B297805) ; 甲醇( 色譜純) 、乙腈( 色譜純) 、無 水乙醇( 分析純) ，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1．3 主要儀器

高效液相色譜儀( Agilent 1100) 及 液相色譜系統(tǒng)( Agilent 1290，包括 G4220A 型二元輸 液泵、G4226A 型自動進(jìn)樣器、G1316C 型柱溫箱) ， 美國 Agilent 公 司; 蒸發(fā)光散射檢測器 ( Alltech 3300) ，美 國 Grace 公 司; 酶 標(biāo) 分 析 儀 ( Multiskan MK3) ，芬蘭 Labsystems Dragon 公司; 超聲波清洗器 ( KH-400KDB) ，鞏義市予華儀器有限公司; 電子分 析天平( XS105) ，瑞士 Mettler Toledo 公司; 電熱恒溫 水浴鍋( XMTD-8222) 、真空干燥箱( DZF-6050) ，上海精宏實驗設(shè)備有限公司; 臺式恒溫振蕩器( THZ82A) 、隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱( PYX-DHS-400-BS- Ⅱ) ，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠; 循環(huán)水式多用真空泵 ( SHB-ⅢA) ，鄭州長城科工貿(mào)有限公司; 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā) 儀( ＲE-52AA) ，上海申生科技有限公司。

2 方法與結(jié)果

2．1 知母乙醇提取物制備

稱取知母飲片 60 g，加 入 6 倍量 50%乙醇，加熱回流提取 2 h，共 2 次。過 濾后合并提取液，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，回收乙醇，水浴蒸 干后轉(zhuǎn)移至真空干燥箱，于 60 ℃ 減壓干燥過夜，制 得知母乙醇提取物。

2．2 知母乙醇提取物酶水解物制備

稱取知母乙 醇提取物和 β-葡萄糖苷酶各 4 g，置于帶塞錐形瓶 內(nèi)，加入 200 ml 醋酸－醋酸鈉緩沖液，放入恒溫振蕩 器，50 ℃條件下振搖 2 h。采用等體積的水飽和正 丁醇萃取提取物 3 次，氨試液洗滌 3 次，合并正丁醇 萃取液，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，回收正丁醇，置于真空干燥 箱，60 ℃減壓干燥，制得知母乙醇提取物酶水解物。

2．3 抗真菌作用比較

2．3．1 抑菌圈實驗

吸取 5 μl 白念珠菌 SC5314 菌 液( 濃度為 1×104 CFU/ml) ，用無菌涂布棒均勻涂布 在培養(yǎng)基表面，每個培養(yǎng)基平板上間隔 20 mm 輕放 2 個無菌牛津杯，每個牛津杯中注入 150 μll 供試品藥液( 知母乙醇提取物及其酶水解物) 。將培養(yǎng)基 平板置于生化培養(yǎng)箱內(nèi)，于 30 ℃ 下培養(yǎng) 48 h，測量 抑菌圈直徑。 結(jié)果顯示，知母乙醇提取物在 320 mg /ml 時對 白念珠菌 SC5314 有一定的抑制作用，抑菌圈直徑 為 6 mm; 其酶水解物在 27 mg /ml 和 13．5 mg /ml 時 對白念珠菌 SC5314 具有抑制作用，抑菌圈直徑分 別為 16 mm 和 12 mm，抗真菌效果顯著升高。

2．3．2 最小抑菌濃度( MIC) 測定

采用微量液基稀 釋法檢測知母乙醇提取物及其酶水解物對 5 種常見 致病真菌的 MIC，并以氟康唑為陽性對照藥物。 將白念珠菌 SC5314 和 Y0109、新型隱球菌、紅 色毛癬 菌、須 癬 毛 癬 菌、石膏樣小孢子菌的菌液 100 μl( 濃度為 1 × 104 CFU/ml) 分別接種于 96 孔 板，加入不同濃度的受試藥物或陽性對照藥物，藥 液終濃度分別為 64、32、16、8、4、2、1、0．5 mg /L，陰性 對照孔不添加任何藥液干預(yù)。白念珠菌于 35 ℃ 靜 置培養(yǎng) 24 h，新型隱球菌于 35 ℃ 靜置培養(yǎng) 72 h，紅 色毛癬菌、須癬毛癬菌、石膏樣小孢子菌于 30 ℃ 培 養(yǎng) 7 d，酶標(biāo)儀測量各孔在 630 nm 處的 OD 值。與 陰性對照孔相比，以 OD 值下降 80%以上的最低藥 物濃度為 MIC80，即真菌生長 80%被抑制時的藥物 濃度。若 MIC80值高于 64 mg /L，計為“＞64 mg /L”。 實驗平行操作 3 次。當(dāng) MIC80值能準(zhǔn)確重復(fù)或只差 一個濃度時可被接受，并以較高濃度作為 MIC80值; 當(dāng) MIC80值相差兩個濃度以上時，則需重新實驗，直 至符合要求。采用單因素方差分析對各組 MIC80值 進(jìn)行 統(tǒng) 計 學(xué) 分 析，P＜0．05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué) 意義。 結(jié)果顯示，知母乙醇提取物的酶水解物對 5 種 真菌的 MIC80均達(dá) 4 mg /L，對石膏樣小孢子菌和須 癬毛癬菌的抑制作用甚至優(yōu)于氟康唑; 與知母乙醇 提取物 相 比，酶水解物的抗真菌活性顯著增強(qiáng) ( P＜0．01) 。TBⅡ?qū)?5 種真菌的抑制作用均較弱，而 TAⅢ對絲狀皮膚真菌紅色毛癬菌、石膏樣小孢子 菌、須癬毛癬菌的抑制作用較強(qiáng)，MIC80達(dá) 4 mg /L。 見表 1。


3 討論

中藥糖苷類成分在體內(nèi)可代謝轉(zhuǎn)化為活性更強(qiáng)的次生苷。本研究利用體外生物酶解技術(shù)模擬 知母藥材有效成分的體內(nèi)水解過程，并采用抑菌圈 實驗和微量液基稀釋法考察酶解技術(shù)對知母提取 物抗真菌活性的影響。體外研究發(fā)現(xiàn)，知母乙醇提 取物對 5 種真菌的抑菌效果均不理想，對白念珠菌、 新型隱球菌、須癬毛癬菌的 MIC80分別為 32 mg /L、 16 mg /L、32 mg /L，對石膏樣小孢子菌和紅色毛癬 菌無明顯抑制作用; 經(jīng) β-葡萄糖苷酶作用后，酶水 解物 對 5 種常見致病真菌的 MIC80 均 降 低 至 4 mg /L。此外，酶水解物中的主要成分 TAⅢ( 含量 52．5%) 對須癬毛癬菌、紅色毛癬菌、石膏樣小孢子菌 的 MIC80均為 4 mg /L，而知母乙醇提取物中的主要成 分 TBⅡ?qū)?5 種真菌的抑制活性均較弱。以上結(jié)果提 示在 β-葡萄糖苷酶的作用下，TBⅡ轉(zhuǎn)化為抗真菌活性 更強(qiáng)的 TAⅢ，后者可能是酶水解物發(fā)揮抗真菌效應(yīng) 的主要有效物質(zhì)之一。臨床上，紅色毛癬菌在皮膚癬 菌中占比最高，可引發(fā)甲真菌病和足癬，而須癬毛癬 菌則是頭癬的主要致病菌，本研究結(jié)果可能為知母治療皮膚淺表真菌病提供參考和思路。

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